杨涟任礼科都给事中，旋即升任太常少卿。春，朱由校拜杨涟为左佥都御史。又升为左副都御史。

然而，这位在杨涟等正直朝臣舍命扶持下才得以登基的朱由校，并没有像东林党所希望的那样革除弊政，相反却是变本加厉，更加荒淫奢靡、昏庸无能。宦官魏忠贤和朱由校的乳母客氏相勾结，在宫中独揽大权，肆意为虐。一些官吏纷纷投靠魏忠贤，结成阉党，打击和排斥东林党人。杨涟怀着满腔的悲愤，决心挺身而出，讨伐魏忠贤。

同年六月一日，杨涟将写好的奏疏藏在怀里，准备趁早朝时面奏朱由校，当场揭露魏忠贤。不巧当日免朝，杨涟恐再宿机泄，只好交会极门转呈朱由校。杨涟在奏疏中列举了魏忠贤的二十四条罪状，揭露他迫害先帝旧臣、干预朝政，逼死后宫贤妃，操纵东厂滥施淫威等罪行，最后指出魏忠贤专权的恶果是致掖廷之中，但知有忠贤，不知有陛下都城之内，亦但知有忠贤，不知有陛下。请求朱由校大奋雷霆，集文武勋戚，敕刑部严讯，以正国法。

杨涟此疏，字字句句，如雷霆万钧，击中魏忠贤的要害。魏忠贤闻疏后惊恐万状，慌忙跑到朱由校面前哭诉其冤，并利用朱由校不识字的缘故，削减罪状。弄得朱由校真假难辨，好坏不分，反而温言抚慰魏忠贤，严旨切责杨涟。

自此以后，魏忠贤对杨涟恨之入骨。同年十月，魏忠贤矫旨责杨涟大不敬、无人臣礼。将杨涟革职为民。

挤走了杨涟，魏忠贤仍不肯善罢干休，必欲置之死地而后快。天启五年，魏忠贤指使阉党大理丞徐大化弹劾杨涟、左光斗党同伐异，招权纳贿，借兴汪文言之狱谋害杨涟等人。锦衣卫北镇抚司指挥许显纯在魏忠贤的授意下对汪文言严刑逼供，要他诬陷杨涟受贿。汪文言宁死不屈，仰天大呼道有贪赃杨大洪哉。许显纯无计可施，只好自己捏造供状，诬陷杨涟、左光斗曾受辽东经略熊廷弼贿赂二万两。魏忠贤立即遣锦衣卫缇骑前去逮捕杨涟等人来京审讯。

六月，杨涟被逮押送北京，沿途群众闻讯，皆为杨涟鸣不平。他们自动夹道哭送，所过村市，悉焚香建醮，

祈佑涟生还。当时，在知府李行志、知县夏之彦等的倡议下，四门设柜，捐俸首倡。士民好义者，倾家乐助。更属僧道，遍化吴楚申浙诸省。但最终只筹集了一万余两。六月二十八日，杨涟被下镇抚司诏狱审讯。许显纯将锦衣卫的诸多酷刑一一用于杨涟，折磨得他遍体鳞伤，气息奄奄。后来提审时杨涟被折磨得无法坐、立，许显纯便让打手给杨涟带上桎梏，拖他到堂上躺在地下受审。杨涟仍不屈服，在狱中写下绝笔，继续陈述移宫案的真相，痛斥魏忠贤紊乱朝纲。魏忠贤得知后气得七窍生烟，令许显纯立即杀掉杨涟。七月庚申夜里，许显纯令缇骑在狱中处死杨涟，此贼先后以土囊压身，铁钉贯耳等手段加害杨涟，但杨涟并未身亡。天启五年农历七月二十四日，许显纯以一枚大铁钉钉入杨涟头部，终将其害死，时年五十四岁。临刑前，杨涟咬破手指，写下血书一封。称欲以性命归之朝廷，不图妻子一环泣耳!写完仰天大笑。

崇祯元年，杨涟之子杨之易、杨之赋向朝廷鸣冤，杨涟冤案得以平反。明毅宗朱由检追录死阉忠臣，以杨涟为首，追赠他为太子太保、兵部尚书，谥号忠烈，赐祭葬，并任命他的一个儿子为官。清顺治六年，杨涟遗骨归葬应山。